第六届中(zhōng)國(guó)國(guó)际进口博览会上，罗氏诊断携手七家國(guó)内领先的NGS领域合作(zuò)伙伴签约共建NGS精(jīng)准医(yī)疗生态圈，充分(fēn)整合各方优势和资源，共同探索和开发基于本土化需求的“样本进，结果出”（Sample In Result Out, SIRO）全流程自动化NGS检测方案。罗氏诊断的SIRO致力于提供NGS样本制备的完整解决方案，搭配高效稳定的文(wén)库构建和捕获产(chǎn)品（包括HyperCap探针和HyperPETE引物(wù)延伸富集产(chǎn)品），基于罗氏诊断全自动建库系统完成湿实验流程，支持多(duō)个测序平台开展不同检测应用(yòng)，助力新(xīn)一代测序技(jì )术（NGS）在实验室落地。此次，罗氏诊断推出了基于真迈生物(wù)测序平台的整體(tǐ)解决方案。
真迈生物(wù)目前已推出GenoCare 1600 系列单分(fēn)子基因测序仪和GenoLab M 系列、FASTASeq 300系列、SURFSeq 5000系列高通量基因测序仪，形成了满足从科(kē)研到临床需求的低中(zhōng)高通量测序产(chǎn)品阵列，实现对应用(yòng)场景的全面覆盖。测序仪是基因测序关键的一环，直接读出碱基序列信息，為(wèi)下游的分(fēn)析解读提供原始信息。今天我们一起来看看，环绕SIRO方案的精(jīng)准医(yī)疗生态圈建设，真迈生物(wù)测序仪与罗氏相遇，将碰撞出什么样的火花(huā)？
基于液相杂交的SIRO方案
1.罗氏KAPA HyperExome V2外显子SIRO方案
罗氏诊断全新(xīn)升级的外显子KAPA HyperExome V2在43.2Mb的紧凑捕获區(qū)域内，提供对新(xīn)版本的ACMGv3.1、RefSeq、CCDS、ClinVar、Ensembl和COSMIC基因组数据库的优异覆盖率，适用(yòng)于医(yī)學(xué)相关应用(yòng)。凭借超过15年的探针设计经验，和通过使用(yòng)T2T(端粒至端粒)基因组版本进行设计优化，HyperExome V2解决了GRCh38基因组版本中(zhōng)潜在的问题區(qū)域。HyperCap工(gōng)作(zuò)流程精(jīng)简了建库捕获的流程，同时高度自动化友好，提供高质(zhì)量的QC表现，即使在极端GC%比例的區(qū)域，也能(néng)获得一致的覆盖率。罗氏诊断首先评估了HyperExome V2在真迈生物(wù)测序平台上的表现。整體(tǐ)来看，真迈测序仪数据质(zhì)量高且稳定，捕获相关的评估指标达到主流水平。其中(zhōng)GenoLab M测序仪的数据冗余度有(yǒu)较明显的降低，可(kě)以提高数据利用(yòng)率；重复两轮上机的结果重现性佳。SURFSeq 5000测序仪作(zuò)為(wèi)新(xīn)机型，在均一性和测序偏好性表现中(zhōng)更胜一筹。
实验设计：以200ng gDNA作(zuò)為(wèi)投入，使用(yòng)KAPA HyperPlus Kit进行建库，HyperExome V2探针进行捕获，建库和捕获的全流程均在罗氏自动化建库仪Avenio Edge System上完成。杂交终文(wén)库，分(fēn)别在GenoLab M 系列（重复两轮上机）、SURFSeq 5000系列高通量基因测序仪和NovaSeq 6000上进行测序。分(fēn)析参照罗氏白皮书——“SPR -White Paper- KAPA TE data evaluation for germline mutations”。
2.罗氏體(tǐ)细胞变异SIRO方案
KAPA HyperCap Oncology panel可(kě)用(yòng)于快速评估體(tǐ)细胞变异检测性能(néng)，靶向214Kb區(qū)域，覆盖商(shāng)业化标准品中(zhōng)最常见的基因，涵盖體(tǐ)细胞肿瘤學(xué)研究相关的13个基因的完整编码序列（ATM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、EGFR、ERBB2、KRAS、MET、MYCN、RAD51C、RAD51D、TP53）以及69个相关基因的热点突变。罗氏诊断评估了KAPA HyperCap Oncology panel在真迈生物(wù)FASTASeq 300测序仪上的表现。下机测序数据质(zhì)量高，Raw data Q30>95%；捕获效率、均一性和数据冗余度的表现佳，fold 80 base penalty可(kě)以控制在1.4以内。将数据截取到0.3G时（FASTASeq 300单次上机可(kě)完成约24个样本测试），去重后的有(yǒu)效覆盖深度达到400X，FFPE标准品中(zhōng)的突变位点均能(néng)稳定检出。
实验设计：以50ng 标准品Horizon FFPE-HD300作(zuò)為(wèi)投入，使用(yòng)KAPA EvoPlus Kit进行建库， HyperCap Oncology panel进行杂交。杂交终文(wén)库，在FASTASeq 300系列高通量基因测序仪和NovaSeq 6000上进行测序。分(fēn)析参照罗氏白皮书——“SPR -White Paper- KAPA TE data evaluation for somatic mutations”。
基于引物(wù)延伸法的快速测序方案
1.肿瘤cfDNA样本體(tǐ)细胞变异检测——引物(wù)延伸法
KAPA HyperPETE采用(yòng)创新(xīn)的引物(wù)延伸靶向富集技(jì )术（Primer Extension Target Enrichment，PETE），3小(xiǎo)时完成快速高质(zhì)量富集，专為(wèi)较小(xiǎo)目标區(qū)域（DNA<250Kb，RNA<50Kb）的靶向富集而设计，可(kě)以检测多(duō)种突变类型：SNV、Indel、fusion(包含未知融合)、CNV和MSI。KAPA HyperPETE Pan Cancer Panel包含86个癌症相关基因和190个MSI位点，支持FFPE和cfDNA的體(tǐ)细胞变异检测应用(yòng)。罗氏诊断选用(yòng)HyperPETE Pan Cancer Panel进行实验，评估真迈生物(wù)FASTASeq 300测序仪在肿瘤低频突变位点的检测性能(néng)。测试结果显示下机测序数据质(zhì)量高，Raw data Q30>95%；捕获效率、均一性表现佳，fold 80 base penalty小(xiǎo)于1.4。原始下机数据约30G，0.1%的突变位点均可(kě)检出，当截取数据至16.5G时（FASTASeq 300单次上机可(kě)完成约5个样本测试），1%的突变可(kě)稳定检出，数个0.1%位点因支持reads少而无法稳定检出。测序仪的台间差小(xiǎo)，数据一致，表现稳定。
实验设计：以50ng cfDNA标准品Horizon-HD780作(zuò)為(wèi)投入，使用(yòng)KAPA HyperPrep Kit进行建库，HyperPETE Pancancer panel进行杂交。杂交终文(wén)库，在NovaSeq 6000和两台FASTASeq 300系列高通量基因测序仪上进行平行测序。分(fēn)析参照罗氏白皮书——“SPR -White Paper- KAPA TE data evaluation for somatic mutations”。
2.融合基因检测——引物(wù)延申法
作(zuò)為(wèi)驱动癌症产(chǎn)生的始因之一，融合基因/剪切变异的检出深受重视。KAPA HyperPETE Lung Cancer Fusion Panel针对17个肺癌融合基因（ALK、AXL、BRAF、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、MET、NRG1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PDGFRA、PDGFRB、PPARG、RET、ROS1）设计，对RNA文(wén)库进行快速富集。罗氏诊断使用(yòng)HyperPETE Lung Cancer Fusion Panel评估FASTASeq 300测序仪在融合检出中(zhōng)的表现。测试结果下机数据质(zhì)量高，Raw data Q30>94%；捕获效率>93%，仅需0.6G raw data（FASTASeq 300单次上机可(kě)完成12个样本测试），即可(kě)将panel设计中(zhōng)覆盖了任一partner的变异检出。而且两轮平行测试展示了FASTASeq300测序仪的台间差小(xiǎo)，表现稳定。
注：粗體(tǐ)字為(wèi)panel设计覆盖的基因，非粗體(tǐ)不覆盖。*為(wèi)panel设计不覆盖该融合位点相关基因。
实验设计：以10ng 标准品Seraseq FFPE Fusion RNA作(zuò)為(wèi)投入，使用(yòng)KAPA RNA HyperPrep Kit进行建库，HyperPETE Lung cancer fusion panel进行杂交。杂交终文(wén)库，在NovaSeq 6000和两台FASTASeq 300系列高通量基因测序仪上进行测序。分(fēn)析参照罗氏白皮书——“SPR -White Paper- KAPA TE data evaluation for somatic mutations”。
本次测评使用(yòng)罗氏诊断建库试剂盒和靶向富集panel，完成了包括gDNA、FFPE DNA、cfDNA以及FFPE RNA样本的测序，覆盖了遗传病和肿瘤NGS检测的不同应用(yòng)场景。测评结果显示，真迈生物(wù)测序平台的性能(néng)表现已达到主流水平，适用(yòng)的文(wén)库类型和应用(yòng)场景多(duō)样。
在高速发展的精(jīng)准医(yī)疗时代进程中(zhōng)，真迈生物(wù)将积极携手罗氏诊断与其他(tā)合作(zuò)伙伴，汇聚优秀科(kē)技(jì )力量，推动NGS技(jì )术创新(xīn)发展，赋能(néng)精(jīng)准医(yī)疗新(xīn)未来。