腺病毒（Human adenoviruses，HAdVs) 是人呼吸道感染常见的病原體(tǐ)之一，可(kě)引起广泛的临床疾病，包括肺炎、支气管炎、膀胱炎、眼结膜炎、胃肠道疾病及脑炎等，在儿童及免疫功能(néng)缺陷患者中(zhōng)症状尤其严重。HAdVs基因型别众多(duō)，且不同型别间或同一型别内均可(kě)发生重组，导致新(xīn)的毒株产(chǎn)生，对公(gōng)共卫生安(ān)全产(chǎn)生极大的影响。传统对HAdVs的诊断及分(fēn)型主要依赖病毒分(fēn)离培养、血清學(xué)及关键衣壳蛋白（capsid）基因的PCR鉴定，费时费力，且对中(zhōng)和抗體(tǐ)等试剂依赖程度很(hěn)高。基于mNGS的病原微生物(wù)诊断，可(kě)以直接对临床样本中(zhōng)的核酸进行高通量测序，而不依赖微生物(wù)的分(fēn)离和培养，能(néng)够快速、客观地检测临床样本中(zhōng)所有(yǒu)未知的病原微生物(wù)，已成為(wèi)感染性疾病精(jīng)准诊断的重要工(gōng)具(jù)。此外，通过对mNGS序列进行病原體(tǐ)基因组组装(zhuāng)，可(kě)以在基因组和基因层面对病原體(tǐ)进行深入的探究。

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研究框架

本研究于2018~2019年，在湖(hú)北省咸宁市某医(yī)院收集400例流感样上呼吸道感染患者的鼻咽拭子样本，对常见呼吸道病毒病原體(tǐ)进行筛查后，确定21例HAdVs阳性患者，共获得25份样本（包含4例病毒分(fēn)离培养样本）。随后，将这25个样本分(fēn)别使用(yòng)GenoLab M及NextSeq 550平台进行宏基因组测序和相关分(fēn)析。

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mNGS组装(zhuāng)完整性及准确性评估

本研究首先对所有(yǒu)下机数据进行测序质(zhì)量评估，确定GenoLab M及NextSeq 550平台均可(kě)获得可(kě)靠的mNGS测序数据。随后对测序reads进行de novo组装(zhuāng)，并评估了组装(zhuāng)的完整度及准确性。结果表明：①在组装(zhuāng)完整性方面（指标：contig数量, N50, N90, 最大contig長(cháng)度，覆盖度），两平台基本一致；②在组装(zhuāng)准确性方面（指标：组装(zhuāng)的基因组与参考基因组的比对率），GenoLab M平台88% (22/25)的样本，NextSeq 550平台84% (21/25)的样本，获得了＞90%的比对率。说明两平台组装(zhuāng)的基因组准确性均较高，可(kě)以进行后续基因组特征的分(fēn)析。

Table1 GenoLab M与NextSeq 550组装(zhuāng)参数表

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平台间mNGS物(wù)种注释结果比较

研究人员对两个平台的mNGS数据进行了物(wù)种注释，发现检出的微生物(wù)种类及丰度高度一致，且HAdVs含量丰富。临床样本相对病毒分(fēn)离培养的样本，检出的微生物(wù)种类更為(wèi)复杂。SE75（图1B）模拟测序与SE150（图1A）测序获得一致的物(wù)种注释结果，说明在基于mNGS的HAdVs感染诊断中(zhōng)，测序时间更短的SE75模式同样适用(yòng)，可(kě)以实现更快速的病原體(tǐ)诊断。

图1 mNGS物(wù)种注释结果比较

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HAdVs基因型分(fēn)类及进化树分(fēn)析

该研究对25个测序样本进行了HAdVs分(fēn)型，共鉴定得到7种HAdVs基因型：HAdV-B3 (n=9)，B7 (n=1)，B55 (n=2)；HAdV-C1 (n=2)，C2 (n=6)，C5 (n=1)；以及HAdV-E4 (n=4)。结果表明，在湖(hú)北咸宁地區(qū)，HAdV基因型多(duō)样性较高，且以B3, C2和E4為(wèi)主。不同的基因型聚类為(wèi)不同的进化分(fēn)支，同一基因型的不同分(fēn)离株聚类為(wèi)同一分(fēn)支。

图2 HAdVs基因型分(fēn)类及进化树分(fēn)析

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不同基因型的全基因组进化树分(fēn)析

為(wèi)进一步探讨不同型别的分(fēn)离株与已发现的参考毒株的进化关系，研究人员对HAdV-B，C，E毒株分(fēn)别进行了全基因组进化分(fēn)析。结果表明：①新(xīn)鉴定的分(fēn)离株与对应的参考毒株形成预期的聚类，且与当地广泛流传的毒株进化关系密切；②B3基因型已开始形成新(xīn)的聚类分(fēn)支，需加强流行病學(xué)监测；③S64、S71和S28分(fēn)离株经重组及全基因组比对分(fēn)析，确定為(wèi)重组毒株。

图3 不同基因型全基因组进化树分(fēn)析

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核苷酸一致性和多(duō)样性分(fēn)析

全基因组核苷酸一致性分(fēn)析表明，HAdVs不同型别间具(jù)有(yǒu)较高的进化保守性，HAdV-B, C和E基因组一致性分(fēn)别达到93.52%，97.49%和96.99%。三个关键capsid基因——penton，hexon和fiber的多(duō)样性分(fēn)析表明：penton基因在HAdV-C中(zhōng)更為(wèi)保守，在HAdV-B中(zhōng)多(duō)样性很(hěn)高，且存在两个明显的高变區(qū)；hexon基因在HAdV-B和C中(zhōng)多(duō)样性更高，同样存在两个高变區(qū)，形成中(zhōng)和抗體(tǐ)识别的表位；fiber基因在三种基因型中(zhōng)，多(duō)样性都很(hěn)高，其C端的γ表位参与血凝抑制，决定病毒的组织偏好性（嗜性）。

图4 病毒全基因组及关键capsid基因核苷酸一致性及多(duō)样性分(fēn)析

基于上述分(fēn)析，我们得出如下结论：

1、mNGS可(kě)以应用(yòng)于临床样本HAdVs的快速诊断；

2、通过de novo组装(zhuāng)可(kě)以得到完整的病毒基因组，其准确性及完整度满足后续基因层面的分(fēn)析要求；

3、新(xīn)鉴定的HAdV-B3分(fēn)离株形成明显的新(xīn)聚类，且与北京株亲缘关系密切，提示區(qū)域传播的可(kě)能(néng)；

4、本次检测到3个HAdV重组病毒株，属于HAdV-B55及HAdV-C2基因型；

5、Capsid基因存在高核苷酸多(duō)样性和高频的重组事件，提示在中(zhōng)國(guó)进行HAdV流行病學(xué)监测的必要性。