近日，浙江大學(xué)医(yī)學(xué)院附属妇产(chǎn)科(kē)医(yī)院生殖遗传科(kē)董旻岳主任团队和真迈生物(wù)合作(zuò)，在Nature 子刊Laboratory Investigation （JCR Q1 医(yī)學(xué)：研究与实验）在線(xiàn)发表题為(wèi)“Non-invasive Prenatal Screening for Common Fetal Aneuploidies by Single Molecular Sequencing”的研究成果，该论文(wén)基于真迈生物(wù)GenoCare 1600单分(fēn)子基因测序仪开展了477例孕妇样本的无创产(chǎn)前筛查NIPS，T13，T18，T21的敏感性均為(wèi)100%，整體(tǐ)特异性也接近100%。
背景介绍
无创产(chǎn)前筛查Non-invasive Prenatal Screening (NIPS)，是基于孕妇外周血对胎儿染色體(tǐ)非整倍性进行筛查的一种方式，主要用(yòng)于T13、T18和T21的检测。目前最常用(yòng)的技(jì )术手段是NGS测序。单分(fēn)子测序不使用(yòng)PCR，理(lǐ)论上可(kě)以去除PCR引入的GC偏向。在本研究中(zhōng)，我们对比了NGS测序平台NextSeq 550和单分(fēn)子测序平台GenoCare 1600在NIPS的测序性能(néng)。
结果概要
图1 入组孕妇的孕周分(fēn)布图
477名(míng)孕妇的孕周分(fēn)布為(wèi)12周-25周+6，峰值在19-20周。195例為(wèi)高龄孕妇（>35岁），占比40.9%（图1），T21，T18和T13的阳性例数為(wèi)107，30和6例。
GenoCare 1600在NIPS的整體(tǐ)表现
测序数据过滤后，平均每例样本获得5.3±1.1 M unique reads，平均读長(cháng)為(wèi)36.3±1.4 nt。梯度截取不同的数据量(1.5 M，2.0 M，2.5 M，3.0 M和3.5 M以上reads)，以探究检测结果所需的最少reads数目，结果发现（图2）：
1. 仅需2 M reads，T13和T18的敏感度（sensitivity）即可(kě)达到100%，而T21需要3.5M以上reads才能(néng)达到；
2. 整體(tǐ)特异性（specificity），随着数据量的增加而增加，在3.5M时，达到最大值97.31%；
3. 2 M reads时，整體(tǐ)的阴性预测值（NPV）和T21的阳性预测值（PPV），均接近100%；
4. 数据量大于3.5M时，T18和T13的阳性预测值（PPV），达到峰值，分(fēn)别為(wèi)99.07%和46.15%。
图2 不同测序数据量下的T13，T18，T21的检测结果
5. 基于Z值的结果和羊水穿刺后胎儿染色體(tǐ)核型结果，T13和T21分(fēn)别有(yǒu)6例和1例假阳性检测结果（图3）。
图3 染色體(tǐ)13，18和21的Z score分(fēn)布
6. 基于227例男胎评估胎儿浓度的检测限，发现正常孕妇的胎儿浓度低于3%，而T21和T18的最低胎儿浓度是3.47%和4.31%（图4）。
图4 单分(fēn)子测序NIPS的胎儿浓度分(fēn)布
GenoCare 1600与NextSeq 550在NIPS的测序性能(néng)对比部分(fēn)样本（对照n=22，T21 n=6， T18 n=2， T13 n=1）同时采用(yòng)NextSeq 550做NIPS检测，计算Z值和GC偏向性ΔRGC2。结果显示（图5）：
1. 单分(fēn)子测序T21，T18的Z值分(fēn)布分(fēn)别為(wèi)6.44–12.52，9.46–24.77，而NGS测序T21，T18的Z值分(fēn)布分(fēn)别為(wèi)3.47–7.52和6.65–21.20，单分(fēn)子测序与对照界限的區(qū)分(fēn)更加明显。
2. 单分(fēn)子测序的GC偏向性ΔRGC2显著低于NGS测序(P<0.001)。
图5 单分(fēn)子测序与NGS测序性能(néng)对比（a）Z score分(fēn)布 （b）GC偏向性比较
讨论与结论
1、GenoCare 1600与NextSeq 550测序仪相比，操作(zuò)更為(wèi)简便，手工(gōng)操作(zuò)2小(xiǎo)时，全流程一天内完成；
2、相对于NGS测序，单分(fēn)子测序无需PCR，GC偏向性更低，实验操作(zuò)更少，对实验室空间要求更低；
3、检索近3年全球基于NGS测序的大人群队列NIPS的研究文(wén)献，发现T13，T18和T21的阳性预测值分(fēn)布0-84.4%，54.84-91.2%，和79.23-100%，单分(fēn)子测序的表现更好；
结 论
因全流程无PCR引入GC偏向，单分(fēn)子测序仪GenoCare 1600可(kě)全方面提升NIPS性能(néng)，而其简单的文(wén)库构建方式，可(kě)以缩短项目交付周期和降低检测成本，今后更多(duō)样本的检测数据会有(yǒu)助于继续提升分(fēn)析算法的准确性。